退火溫度（Annealing Temperature）[1] 為引物和模板結合時候的溫度參數，當50%的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度.它是影響PCR特異性的較重要因素。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火， 同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的 Tm低5℃。
　　在模板變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃(某個退火溫度)的時候，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞，這就使PCR后期的過程成為可能。
　　退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)
　　復性溫度=Tm值-(5～10℃)
　　在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。
　　在金屬加工領域，退火溫度是指退火時金屬應加熱達到的溫度。據有關文獻介紹，不同金屬材料的退火溫度為：鉑，900—1000℃；銅，650℃；黃銅，600—650℃；鎳銀，650—680℃；鋁，283—350℃等。